数据分析中用到的参考数据包括参考基因组和转录组的序列、基因在基因组上的定位信息，这些参考数据的文件名字、版本以及下载的地址包含在中。另外，分析过程中用到的软件及其版本信息详情见表 2。

表 1.  分析过程中使用的参考数据信息

表 2.  分析过程中使用的软件信息

* 网址： 

rMATS : http://rnaseq-mats.sourceforge.net/;

clusterProfiler: https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html;

Stringtie：https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/；Hisat2：https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml

IGV：http://www.broadinstitute.org/igv/；RseQC：http://rseqc.sourceforge.net；

skewer：https://sourceforge.net/projects/skewer/

edgeR：http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html 

RseQC：http://rseqc.sourceforge.net/

FEELnc：https://github.com/tderrien/FEELnc

FastQC：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ 

生物信息学分析内容

1. 对比分析（mRNA和LncRNA）

利用Stringtie软件和人源转录组数据库信息，对样本进行转录本组装；组装完成后再合并所有样本的组装成的转录本；再利用FEELnc软件对合并后的转录本进行LncRNA鉴定；除开LncRNA，其他为mRNA。

图1：mRNA和LncRNA的exon数目统计和ORF长度分布统计

2. 差异表达分析

通过reads的基因组定位信息再结合mRNA的注释信息，我们可以统计出每个基因上的reads count计数。用edgeR统计组间表达基因的数目；且取FDR<0.05，表达差异2倍以上的基因作为显著差异表达基因。

图2：差异表达基因分布的volcano图

表 3.  基因表达差异分析结果（例）

3. PCA分析和聚类分析

对多变量基因表达数据进行主成分（PCA）分析和聚类分析，以评估组内样本的重复性和不同组样本之间的差异性，以剔除异常样本；并可以很直观反映出不同实验条件下样本差异表达基因的变化情况。

图3：PCA主成分分析

图4：聚类分析

4. 基因注释和功能分析

Gene Ontology（简称GO）是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表（Controlled Vocabulary）来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。

GO分析总共有三个Ontology，分别描述基因的分子功能（Molecular Function）、细胞组分（Cellular Component）、生物过程（Biological Process）。采用clusterProfiler注释工具进行GO分析，计算得到的p-value通过校正之后，以q<0.05为阈值，满足此条件的GO条目定义为在差异表达基因中显著富集的GO条目。通过GO功能显著性富集分析能确定差异表达基因行使的主要生物学功能。

图5：TOP 10的GO富集条目

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）是基因组破译方面的数据库。在给出染色体中一套完整基因的情况下，它可以对蛋白质交互（互动）网络在各种各样的细胞活动过程起的作用做出预测。KEGG的PATHWAY数据库整合当前在分子互动网络（比如通路、联合体）的知识，GENES/SSDB/KO数据库提供关于在基因组计划中发现的基因和蛋白质的相关知识，COMPOUND/GLYCAN/REACTION数据库提供生化复合物及反应方面的知识。

其中，基因数据库（GENES Database）含有所有已知的完整基因组和不完整基因组。有细菌、蓝藻、真核生物等生物体的基因序列，如人、小鼠、果蝇、拟南芥等等；通路数据库（PATHWAY Database）储存了基因功能的相关信息，通过图形来表示细胞内的生物学过程，例如代谢、膜运输、信号传导和细胞的生长周期；配体数据库（LIGAND Database）包括了细胞内的化学复合物、酶分子和酶反应的信息。对KEGG中每个Pathway应用超几何检验进行富集分析，找出差异表达基因显著性富集的Pathway。

图6：TOP 10的Pathway富集条目

每个点表示该KEGG条目的富集程度，颜色越趋近于红色表示富集程度越高。每个点的大小表示富集到该KEGG条目的基因的个数，点越大表示富集到该KEGG条目的基因越多，反之则越少。

5. 可变剪切分析

mRNA前体经不同的剪接方式或选择不同的剪接位点将产生多种mRNA剪切异构体，该过程即称为可变剪切（AS）。可变剪切(Florea, et al., 2013)广泛存在于真核生物中，是调节基因表达和蛋白质多样性的重要机制。

可变剪切事件的类型整体有以下5类，如下图所示：

图7：5种主要可变剪切的示意图

使用软件rMATS(基于鉴定得到的lncRNA和mRNA转录本)对分组样本进行比较，得到样本间差异可变剪切。

图8：可变剪切示意图

6. LncRNA分析和靶基因预测

对于通过比对分析发现的LncRNA数据，通过预测靶基因（Cis作用靶标和Trans作用靶标）间接预测其功能。

Cis功能预测基本原理。是依据LncRNA的功能与其坐标临近的编码蛋白基因相关。根据找出同LncRNA基因相邻的（上下游20K）蛋白编码的基因对LncRNA筛选。

Trans靶标预测原理，是首先根据LncRNA和基因的表达量计算LncRNA和基因之间的相关性，并且根据相应GTF文件和基因组文件提取对应的Fasta序列，使用RNAPlex根据提取的Fasta序列，计算LncRNA和基因序列之间的结合自由能来预测反式作用靶标。根据自由能和相关性筛选预测靶标，筛选标准Cor>0.75。