microRNA实时定量PCR技术
发布时间：2019-05-09 分享到：
miRNA有高等生物基因组编码,通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译。其在物种进化总相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中其多种作用。成熟microRNA是由21-25个核苷酸组成的小RNA，由于长度太短，不能通过传统的实时定量PCR进行检测。本公司通过特殊设计的茎环结构的反转录引物，配合实时定量PCR引物及探针可以精确检测微量样品中microRNA表达水平，也可以用终点PCR法定性检测。
服务流程：
1. 引物设计、合成：设计并合成目的microRNA的茎环RT引物、PCR引物和检测用荧光探针，并合成该microRNA相应的DNA寡核苷酸作为标准。
2. 样品RNA抽提：
a．组织样品：取适量（50～100mg）新鲜组织或正确保存的组织样品，匀浆后用PURELINKTM试剂抽提RNA。
b．细胞样品：取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，吸去PBS后用PURELINKTM试剂抽提RNA。
3. RNA质量检测
a．紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值，获得RNA的浓度并通过A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。
b．甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。
注：用于microRNA实时定量PCR检测的RNA样品，必须高纯度、完整，没有RNase污染（降解的样品不能用于实时定量PCR检测），同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。
4. 逆转录合成cDNA：利用茎环引物逆转录合成cDNA第一链。
5. 实时定量PCR：以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增，梯度稀释的标准同时进行实时定量PCR扩增，根据Ct值制备标准曲线。以同样的方法测定每个样品中U6 snRNA含量作为内参，校正上样误差。
6. 分析结果、提供实验报告：分析实时定量PCR结果，根据标准曲线定量样品中的目的microRNA。提供实验报告，包括详细的实验方法，实时定量PCR实验数据和图表。
技术优势：
1检测具体：可以检测成熟miRNA和区分相关的甚至低至一个核苷酸的mRNAs
2灵敏度高，特异性强，精密度高：允许无需核苷酸纯化，直接分析单个细胞
3快速，准确：能识别和监控特定组织或疾病的潜在生物标志物。
样本要求：
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